SEM Fisher蛋白质组解决方案在线讲座

最近，Simmerfelder蛋白质组学的市场专家唐佳发表了一篇题为蛋白质组学研究方法和热蛋白质组学解决方案的报告。本文主要介绍基于生物质光谱技术的蛋白质组学研究方法和技术，包括蛋白质的高通量分离和高通量分离、鉴定、定量蛋白质组学、翻译后修饰蛋白质组学、Top Down蛋白质组学等。在。

蛋白质组学是研究生物体内的所有蛋白质，其目的是发现它们的组成和活性模式。蛋白质组学是蛋白质组学和功能蛋白质组学的两类。细胞、组织和生物体内的所有蛋白质，并分离、鉴定、定量和定位这些蛋白质，以构建细胞、组织或生物体完整的蛋白质表达谱。功能蛋白质组学研究蛋白质、蛋白质结构、蛋白质的翻译后修饰。在定位上，研究蛋白质表达与功能的关系，研究蛋白质之间的相互作用及其意义，构建蛋白质功能网络。

蛋白质的基本结构是氨基酸序列，通过鉴定氨基酸序列来与其蛋白质匹配。这是定性研究和蛋白质组学研究的基础。目前，蛋白质组学已经形成了大规模、高通量的基于生物质光谱的蛋白质分离、鉴定和分析。自底向上和自顶向下是基于质谱的蛋白质组学分析的两种主要方法。测量法。自顶向下(Top-down，top-down)技术可以直接测序包括转录后修饰蛋白和其他大片段蛋白质在内的完整蛋白质，但不能测序肽序列；自底向上(.-up，.-up)技术是混合大片段蛋白质的技术。基因组学将肽消化成小片段，然后分析它们。

LTQ-OrrrAP-VelOS轨道阱质谱仪

生物体内蛋白质种类繁多，性质复杂，数量多，动态范围广。因此，在进入质谱分析之前，必须对蛋白质样品进行预分离，传统的预富集技术包括二维凝胶电泳、多维液相色谱、毛细管电泳等。也有一些特殊的分离方法，如富集和分离低丰度蛋白质。唐博士说，成功的蛋白质组学实验必须包括样品制备、LC-MSMS分离鉴定和数据处理分析软件。热能可为蛋白质组学研究提供全面的解决方案，如蛋白质富集、细胞裂解、酶解、同位素标记等生物样品预处理；液相色谱、质谱、数据处理等。软件和其他蛋白质组学鉴定，定量解决方案。

LTQ系列轨道器是热释光中最高端的组合质谱仪，LTQ轨道器组合质谱仪将LTQ与专利轨道器技术相结合，为LTQ的灵敏、快速基础增加了高分辨率、高质量和高精度。它具有快速、灵敏、可靠地从复杂系统中检测化合物的能力。LTQ互补轨道仪的所有分析性能和样品界面特征都与轨道仪的宽动态范围、高灵敏度、高质量精度和高分辨率相辅相成。在代谢物鉴定和自下而上的蛋白质组学中，数据采集和分析软件可以将LTQ轨道仪强大的分析性能转换为准确和灵活的结构。立即可用的数据信息。

适当的样品前处理和分离方法，结合高性能质谱和数据处理软件，允许高通量蛋白质的发现和鉴定、蛋白质的相对定量和翻译后修饰的蛋白质组学研究。VIER软件平台是一个综合性和可扩展性的软件平台，可以定性和定量地分析蛋白质组数据，而不是BioWork，PROME发现器是第一个商业蛋白质组数据分析平台，它允许研究人员合并、比较和分析数据FR。蛋白质组发现者的主要优点之一是它能够从多种裂解方法中分析信息，以发现更多的翻译后修饰（PTMS），并提高肽和蛋白质鉴定的准确性。对蛋白质识别的研究是建立一系列的搜索，可以灵活地选择不同的搜索方式，建立不同的搜索方式，建立统一的提交后搜索。多样化的功能，为用户提供多种选择。

LTQ OrrrRAP电场轨道陷阱回旋共振质谱仪

定量蛋白质组学中传统的定量方法是二维凝胶电泳，它基于蛋白质的分子量进行二维分离，具有直观的优点，但缺点是亲水性或疏水性蛋白质具有鉴别作用。凝胶蛋白质组学定量方法也比传统的凝胶技术灵敏得多。近年来，基于质谱的蛋白质组学定量方法发展迅速，包括同位素标记法和非标记法。非标记技术。蛋白质组定量和小分子定量有不同的地方。这些不同的地方与蛋白质组学特征有关。蛋白质表达水平动态变化，蛋白质种类繁多，动态范围宽。蛋白质作为载体的优雅度很高，但生理相关蛋白的丰度很低。

半定量技术可用于基于质谱的相对定量。同位素标记技术相对简单。目前有两种常用的标记方法：体内标记（ICAT，ITRAQ）和体外标记（TMT，SILAC）。ICAT同位素标记技术，含有蛋白反应基团的试剂，乙烯-甘油结合区和生物素标记，目前主要由ABI促进。ENT，商业ICAT试剂可以特异性地与蛋白质或肽L2半胱氨酸的巯基反应。同位素标记为含有8个氢原子（D0）和含有8个氘原子（D8）的重试剂的光试剂。ITRAQ是ABI开发的质谱定量方法，可同时标记四个不同的样品（最新的标签可以标记八个不同的样品。其原理是标记具有非聚合物相同标签的肽段。标签包含报告组、平衡组和肽反应组。不同的报告组与相应的平衡组相匹配，以确保总分子量为145。肽反应组将ITRAQ标签连接到肽段的N-末端基团和每个赖氨酸侧链，以标记所有酶肽。TMT现在可以标记6个平行R。TMT是一种与肽中的氨基酸发生反应的体内标记方法。取出所有样品后，提取的蛋白质与衍生物反应。为了提高蛋白质和衍生物的衍生效率，需要优化蛋白质和衍生物的量，通过向培养基中添加稳定同位素标记的必需氨基酸如赖氨酸和亮氨酸苯丙氨酸，SILAC用于鉴定和定量高等动物细胞中的蛋白质。

在生物标志物的研究中，在进行深入的有针对性的研究之前，必须发现数量上有显著差异的蛋白质，包括绝对定量研究。基于大量生物质光谱数据筛选生物样品的生物标志物。

SIEVE是一种无标记的定量分析软件，可用于质谱数据处理，以提供关于SIEVE选择的特定蛋白质和趋势的信息。这些结果具有统计学上的显著意义。它不仅可以用于肽和蛋白质，还可以用于小分子，如代谢组学。在获得生物标记物后，我们可以绝对地定量所选择的靶蛋白，为医学提供靶蛋白定量分析方法。诊断。三四杆技术已广泛应用于生物光谱学中的小分子定量，也可以用于高通量的大分子肽。N复合蛋白质混合物，产量可重复。

热蛋白质组学溶液

磷酸化蛋白质组学比较简单，即蛋白质磷酸化修饰中的一些氨基酸基团，丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化是生物体内最常见的磷酸化类型。在目前的工艺条件下，利用一些特殊的分离富集技术与生物量光谱技术相结合，可以实现蛋白质磷酸化氨基酸残基和磷酸化蛋白质的大规模高通量定位。针对磷酸盐损失引起的中性损耗的特殊峰，采用串联质谱法分析磷酸肽。

糖基化蛋白质组学比磷酸化蛋白质组学稍微复杂一些，主要是由于糖链的复杂结构。在除去O-和N-糖的糖链后，鉴定出大规模和高通量的糖基化位点。糖链、大规模分析和匹配的糖链仍面临巨大挑战。例如，N-糖基化位点的鉴定，糖苷酶可以用来去除N-糖的糖链，N-糖的位点可以通过加入1道尔顿来判断。通常需要通过三个或更多个多极质谱来鉴定糖链的结构。

自下而上只能获得不完整的肽序列，因此进行了自顶向下蛋白质组学研究。自顶向下识别并定位了PTMS、RNA、氨基酸衍生物等的可变剪接。它还识别和量化蛋白质亚型，然后研究信号和调节网络通常由PTMS调节。这些因素共同决定了蛋白质的活性状态、定位、转移和相互作用，自顶向下蛋白质组学研究的关键是质谱和软件。蛋白质的分子量非常大。如何选择合适的质谱条件是自顶向下技术的第一步，在软件方面，THEMOO提供PualTPC软件来支持自顶向下的研究。PaluPC可以识别对给定的蛋白质或肽的未知质量修饰，可能是由于小肽片段、同源替代物、翻译后修饰或由于样品预处理而导致的人工缺陷的损失，并且不需要预先知道什么KI。装饰装修。

通过色谱和质谱的丰富度，实验过程中某一蛋白质的损失率有多大，损失率和蛋白质的性质与损失率能否估计有关。

唐佳博士：这个问题确实存在。如果处理得当，蛋白质的回收率可达90%以上。它取决于仪器的条件、塔的条件和操作的熟练程度，因此，不可能给出一般的损失率，但是损失率可以控制。

唐佳医生：第一步是iSRM检测，第二步是数据触发，第三步实际上是检测，虽然有很多定义，但是速度仍然很快，不会影响识别的速度。

关于TOP下降的研究，你可以做多少分子量，比如50K蛋白质，序列覆盖率可以多高，你认为这项技术现在可以做多少分子量，难点在哪里

唐博士：50K的蛋白质不是问题。肽的覆盖率不仅与质谱有关，而且与样品处理有关。我们应该尝试结合仪器的所有碎片方法，这对肽的覆盖非常有帮助，建议使用自底向上的方法来增加肽的覆盖率，并且应该使用蛋白酶的组合来研究肽。

网友：精准软件生成的MRM方法，我从你的讲座中得到的，你是高通量MRM还是Isrm方法，成功率大约是60分钟梯度，做1500次MRM，成功率

唐佳博士：肽中离子对的检测与选择的离子对有关。如果选择的离子对特别合适，并且经过实际优化，成功率很高；否则，成功率会受到影响。当然，这与实验条件有很大关系。

唐佳博士：TMT与肽类中的氨基酸反应。它是一种体内标记方法。取出所有样品后，提取的蛋白质与衍生物反应。需要优化蛋白质和衍生物的量以提高衍生物的效率。SILAC不存在衍生效率问题。它提供了两个平行的样本。一个是氢同位素未标记，另一个是重氢标记的氨基酸。标记物的数目也不同。TMT可以在处理后唤醒标记的样品，而SILAC只能在培养基中标记。

唐佳博士：蛋白质的提取经常受到人类角蛋白等的污染。所以我们做实验的时候要扎头发，戴帽子，戴面具。另外，我们还要选择质量更好的手套、胶管和塑料管。